excel表格_excel函数公式大全_execl从入门到精通
竹叶青的分类分析2024-05-13 22:01:32
根据《四川动物》杂志记载，赵尔宓等人将竹叶青蛇属（Trimeresurus）分为六种，包括白唇竹叶青蛇（T. albolabris），台湾竹叶青蛇（T. gracilis），墨脱竹叶青蛇（T. medoensis），竹叶青蛇（T. stejnegeri），西藏竹叶青蛇（T. tibetanus）和云南竹叶青蛇（T. yunnanensis）。然而现在狭义竹叶青蛇属的另一种分类在逐渐被国内外学者和爱好者所接受，国际上将竹叶青蛇属下分了8个亚属，分别为Cryptelytrops亚属，Himalayophis亚属，Parias亚属，Peltopelor亚属，Popeia亚属，Trimeresurus亚属，Viridovipera亚属，Trimeresurus gracilis亚属我国动物志和文献的记载与国际上的分类存在矛盾之处。
国内虽然有很多学者研究竹叶青蛇的分类，但是大多数是通过形态学的观察和解剖学的分析对蛇进行分类判定，然而国际上对蛇的研究倾向于通过建立分子发育树，建立物种亲缘关系的鉴定。目前为止，在NCBI基因库里面还没有公开的竹叶青蛇海南亚种的基因全序列。因此，对竹叶青蛇海南亚种的分子系统学的研究比较迫切。本文着重从蛋白质角度，探讨竹叶青蛇属的分类和海南产竹叶青蛇是否是处于亚种地位。
竹叶青海南产竹叶青蛇的蛋白质序列，海南产竹叶青蛇DNA，并对其纯化后做PCR实验。
从Genebank上下载竹叶青蛇属下各亚属的种类的基因片段，通过找出蛋白质序列，采用邻位相连法建立分子系统发育树来分析海南产竹叶青的分类问题。对于海南产竹叶青的分类，从两个方面来做准备。第一步，捕捉海南竹叶青，统计形态学特征和记录解剖学特征。第二步，提取DNA，纯化后，做PCR实验，测得目的基因序列。
竹叶青（Trimeresurus）隶属于蝰科，通身呈现翠绿色，眼睛多呈现出红色，有些也常为黄色，瞳孔形状通常为垂直线型，蛇尾为红色，呈暗色，具有极高的观赏价值。竹叶青蛇生活环境在平原区、低山区或小丘，通常栖身在河沟、溪水、田埂或田野杂草中，有时也出现在小灌木或树枝上，住宅附近常常会有竹叶青蛇的踪迹，其活动时间不分昼夜，捕食通常在夜间进行。吃蛙、蜥蜴及鼠类。卵胎生。据在香港观察，6-7月产仔蛇11-13条，初生仔蛇有卵齿，清楚可见，全长约200mm（Romer，1963）。其主要分布区为亚洲的印度、东南亚、中国南部以及太平洋上的岛屿，可分为30多种，其在台湾有“青竹丝”别称，属于出血性毒蛇，毒性主要为造成血小板凝固功能障碍。
广义竹叶青蛇属Trimeresurus (sensu lato)在蝮亚科蛇中是一个较大的类群,从属的物种有40余种,广义竹叶青属在东亚、东南亚和南亚的国家及地区中都均广泛分布。Trimeresurus(sensu lato)其物种多样性极高，种类丰富。广义竹叶青属的地理分布中,有些物种分布广泛,部分物种也分布在较小范围的区域内;有些分布在高海拔的山地,部分分布在中低海拔的地区内。广义竹叶青属生活环境,大多在树上，也有部分生活在陆地上。广义竹叶青属生殖,有的为卵生，也有卵胎生的方式。广义竹叶青属有多种体色,体型上也有较大的差异。一般认为该类群划分上有6属：Trimeresurus sensu stricto, Ovophis,Protobothrops, Zhaoermia, Tropidolaemus, Triceratolepidophis。近期通过半阴茎的形态以及分子系统学的研究成果,Ovophis和Trimeresurus (Sensu stricto)又被进一步地划分。虽然之前的学者们从细胞、分子水平和竹叶青属的形态上对竹叶青属的分类及其系统的演化进行比对。然而受到了多种因素及条件的限制,眼下依然存在着各种不同的声音。对此，我们提出各属应包含哪些物种、如何确定一些栖息区域小，种群数量少的种类的系统地位、怎样弄清一些大范围分布种类的种下系统关系、如何找到一些缺乏相应的形态学证据得种属等问题。
海南岛位于中国最南方，其主要产竹叶青为白唇竹叶青，偶有少量的福建竹叶青。白唇竹叶青蛇与赤尾竹叶青蛇的外部特征极为相似，然而白唇竹叶青蛇尾部的红色花纹并未将整个尾部绕起来，且白唇竹叶青蛇也没有类似于赤尾竹叶青蛇的侧边白线。白唇竹叶青蛇与福建竹叶青蛇相似，但是白唇竹叶青蛇的鼻鳞和上唇瓣的第一枚鳞片完全愈合，或者有一道很短的鳞沟。白唇竹叶青蛇和其他种类的主要区别为白唇竹叶青蛇的背部和腹部之间存在一条白线，这条白线一直到其嘴巴的下方，不注意观察会认为它的唇部为白色的，其中在雄性类群中较为明显。在反应分类特征的本质上，生物体内特异的蛋白质组成比生物的外表特征具有更好的反应。以蛋白质进行具有一定差别的演变程度的依据，将几类蛋白质作为各个分类阶段的指标。运用一定依据的实验方法，再与传统分类方式进行结合,在弄清楚竹叶青属的分类问题，以及解决被蛇咬伤的治疗工作上,有一定的实践与理论方面的意义。竹叶青属蛋白质序列基因ND1-ND6、COX1-3、ATP8相似度在60%~90%。对于蛋白质空间结构的相似性，可通过对12s、16s、cytb、ND4、COI扩增来比较差异。
海南产白竹叶青蛇、竹叶青蛇、白唇竹叶青蛇、黑斑水蛇、滑鼠蛇、眼镜蛇的蛋白质序列基因ND1-ND6、COX1-3、ATP8。
1.研究方法
氨基酸统计、序列比对、差异统计，密码子偏好统计、分子系统发育树建立。
2.分子系统学法
分子系统学是指通过对生物大分子（核酸、蛋白质等）的结构以及功能等的进化研究，阐明生物各类群（以及已经灭绝的生物类群）间的谱系关系。
3.主要建树方法
ML、ME、NJ、MP。
4.主要使用软件
Cromas、Seqman、Editseq、Mega、Clastul等。
5.使用工具书与数据库
《中国动物志》、《中国蛇类》、NCBI、Reptile data base。
统计学处理
应用SPSS19.0统计软件进行所得到的数据的处理与分析，数据采用均数±标准差(x±s)表示。若数据满足正态性和方差齐性的组间均数比较用单因素方差分析中最小显著差法(LSD)法两两比较。上述显著性检验水准以P＜0.05表示。
按照Millipore公司96纯化板操作流程操作：向96纯化板孔中加入100ul ddH2O,取出PCR产物至96纯化板中室温静置10分钟，真空抽滤泵抽10分钟至抽干，向96孔纯化板中加入40ul ddH2O，室温溶解10分钟，取出对应的孔中的纯化产物至另一96孔PCR板中。
1.2PCR产物测序
序反应体系为：2μL Mix(Bigdye3.1、5X sequencing buffer、H2O),2μL纯化后的PCR产物，1μL引物（5mmol/L）。
测序反应程序为：循环条件为：95℃ 15s（95℃ 15s50℃ 5s60℃ 90s）×35cycles终止反应。
2.分析方法
2.1比较竹叶青属的形态学特征
用Excel统计比较竹叶青属各属的形态学特征。
2.2分析海南产竹叶青蛇的分类地位
用生物软件DNAstar中的seqman和editseq对海南竹叶青和竹叶青属种类基因序列进行比对、编辑，用ClustalW对基因学列进行比对分析，用Mega将有差异的序列剪切平齐，用DNAsp对序列进行转换格式，构建分子系统发育树，讨论亲缘关系。研究海南产竹叶青蛇的分类地位。
海南产白唇竹叶青蛇和竹叶青蛇在腹鳞、前端背鳞、中段背鳞、后端背鳞、左上唇鳞、左下唇鳞、右上唇鳞、右下唇鳞、左眶前鳞、左眶后鳞、右眶前鳞、右眶后鳞、右眶上鳞、右眶下鳞尾下鳞、前中后段腹鳞宽度、前中后段直径、卵数目、体长的比较
1.我们利用MEGA软件来完成建树的过程首先我们选择了海南产的竹叶青和白唇竹叶青及眼镜蛇的蛋白质序列建树，以下是他们的凝血酶样丝氨酸蛋白酶蛋白质序列。
建树过程
首先我们下载了蛋白质序列之后，在下载MEGA软件，然后安装MEGA软件然后打开这个软件，然后点击ALLG
然后点击EDIT/BUILD ALIGRMENT按钮然后选择第一个CREATE A NEW ALIGNMENT
再把下载的序列复制进去再把他们都排列整齐再选择对比序列再选择DATA选项里面的PHYLOGENTIC ANALYSIS这里在选择 YES然后保存在桌面出现这个界面，然后再选择ANALYSIS选项再选择PHYPGENY里面的第二个选项在弹出的对话框里面选择YES最后选择OK选项最后我们就得到了蛋白树使用同样的方法我们做出了5种不同蛋白质树。
从蛋白质树我们可以看出海南产竹叶青和白唇竹叶青以及其他不同地区竹叶青的支持率是很很高，他们之间序列的基本完全相似，但是和其他其他外群对比眼镜蛇黑斑水蛇黑曼巴蛇之间的物种类型相差的就比较远，说明竹叶青在属性分类上是属于竹叶青属。
结合对PCR纯化序列的测定结果和对海南产白竹叶青蛇、竹叶青蛇、白唇竹叶青蛇、黑斑水蛇、滑鼠蛇和眼镜蛇的12s、16s、cytb、ND4、COI结果统计，可以发现，它们的空间折叠方式类似，推测它们可能具有相同的生理功能。
从蛋白质序列上来看，海南产竹叶青蛇、白竹叶青蛇、白唇竹叶青蛇、和黑斑水蛇、滑鼠蛇、眼镜蛇的蛋白质序列，氨基酸信息，螺旋结构有一定的相似性，初步推测它们具有相似的生理功能。
从分子树角度来看，海南产竹叶青的分类，从邻接法构建边缘，其基部与我国福建大陆连在一起，也可以说是在海南。白唇竹叶青蛇、竹叶青蛇，在海峡未形成时存在于福建大陆的半岛。研究表明地球的气候存在冰期和间冰期的旋回化特征。竹叶青属中的此种蛇类汇聚，故海南产竹叶青蛇与处于亚种地位的竹叶青属有联系。
从形态学上来看,海南产竹叶青蛇与其他竹叶青属蛇类相似程度较高;从分子系统发育树上来看,海南产竹叶蛇青从属于竹叶青属,。海南产竹叶青蛇可能属于处于亚种地位的竹叶青属。
竹叶青属蛋白质序列基因ND1-ND6、COX1-3、ATP8相似度在60%~90%。蛇毒丝氨酸蛋白酶具有高度的序列相似性（60%~80%），但底物专一性却有较大的分化。对于蛋白质空间结构的相似性，12s、16s、cytb、ND4、COI扩增显示出的差异比较见图4。
通过采集海南岛不同方位的白唇竹叶青蛇、白竹叶青蛇、竹叶青蛇、黑斑水蛇、滑鼠蛇、眼镜蛇,PCR扩增其12S、16S、Cytb、COI、ND4四个线粒体基因序列,共约1 446 bp,并从GenBank下载了10个个体的Cytb、COI和ND4基因序列;通过绘制单倍型的统计简约网络图,进行原始单倍型分析,再绘制扩散路线图。结果显示,采自海南岛西部的单倍型较多,故初步得出结论,海南产竹叶青的迁徙路线很可能自西向东扩散。结合生物地理学信息,发现早期竹叶青蛇基本是由西向东的扩散路线,同样印证中国海南地区竹叶青蛇大体是由西部向东部扩散的总体趋势的结论。
竹叶青（Trimeresurus）隶属于蝰科，通身呈现翠绿色，眼睛多呈现出红色，有些也常为黄色，瞳孔形状通常为垂直线型，蛇尾为红色，呈暗色，具有极高的观赏价值。竹叶青蛇生活环境在平原区、低山区或小丘，通常栖身在河沟、溪水、田埂或田野杂草中，有时也出现在小灌木或树枝上，住宅附近常常会有竹叶青蛇的踪迹，其活动时间不分昼夜，捕食通常在夜间进行。吃蛙、蜥蜴及鼠类。卵胎生。海南产竹叶青蛇与其他竹叶青蛇相似度较大，对于其分类地位，初步认为属于亚种地位的竹叶青属。
现代科技的发展，带动分子生物学以及生物信息学向前发展，尤其生物分析软件的开发，让学者们极大地增加了其对分子序列进行工作的效率。现在对各种序列的比对非常容易，且方便分析它们之间的联系和差别。本研究在探讨海南产竹叶青蛇属的分类时主要用分子生物学方法，分析12S、16S、Cytb、COI、ND4等，相对其他，16s的进化速率相对较慢，适合做属间进化分析。本工作为研究海南产竹叶青蛇的分类地位提供了有益的资料，为其生物学功能的研究奠定了基础。为研究海南产竹叶青蛇的迁徙路线,从Gen Bank上得到它的部分cytb基因序列,长为655bp,再用Seqman对序列进行格式剪切、转换与校正,接着利用MEGA6.0进行序列比对,统计碱基含量和变异位点。运用Microsoft Visio 2007软件绘制cytb部分序列统计简约网络图。用分子方法推断物种扩散,为新兴的分子生态学研究方法,可以广泛应用于未来的地理学研究。
标签: excel统计不同种类数量