摘要：人工心脏瓣膜中的合成聚合物瓣膜有可能减少钙化和血栓，同时改善血流、耐久性和设备经济性。最近开发的有机硅聚氨酯共聚物（LifePolymer，LP）具有心脏瓣膜所必需的特性，包括低动态模量、高拉伸强度、最小蠕变和出色的生物稳定性。LP的特性来自于精心设计的 "连接的共聚物 "化学成分，它最大限度地提高了有机硅含量和软、硬相之间的虚拟交联。对多个商业批次的表征表明，合成过程稳定，变化最小。广泛的基于ISO 10993的生物相容性测试结果显示，没有观察到毒性或其他不良反应。体外房室分流术血栓形成的调查显示，血小板在LP表面的附着和血栓形成的水平几乎无法检测到。对带有LP叶子的原型心脏瓣膜进行的长期的母猪植入试验显示，与临床上标准的组织型瓣膜相比，其血栓形成性或全身组织反应没有差异。根据对LP型心脏瓣膜的可萃取物和可浸出物的分析，毒理学风险评估确认了最小的毒理学风险。最后，24周的应变加速体内LP生物稳定性测试证实了以前良好的体外生物稳定性的发现。这些研究表明，这种新开发的弹性体表现出理想的生物材料特性，可用于完全合成的心脏瓣膜替代物的柔性叶片。
一、简介
作为(AB)n型嵌段共聚物，聚氨酯(PU)由三种主要的化学构件组成，并以定制的共价连接序列产生聚合物链段。这些聚氨酯的化学成分通常是：1）大二元醇或多元醇，2）二异氰酸酯，以及3）扩链剂。这三种成分的无数化学组合，每一种都有几种不同的化学可能性，从而产生了大量具有有趣的有用特性的聚氨酯。定制的聚氨酯机械和化学特性来自于其分子水平的结构，产生独特的硬段和软段，根据分子间的力量（如链氢键）、段的联合和相对不溶于水的情况进行自我组织，形成微相分离的聚合物固体。长期以来，人们一直认为聚氨酯的微相分离对其引人注目的机械（如拉伸强度、弹性性能、硬度）和化学行为（如气体/水渗透性、水解稳定性、生物相容性）至关重要。
许多学术和临床医疗植入物的开发经验表明，聚氨酯的化学特性与它的生物相容性和生物稳定性有很大关系。采用和重新利用其他商业应用中的早期聚氨酯材料用于医疗设备，取得了许多成功，但也出现了一些明显的性能挑战。具体来说，商业化的聚醚聚氨酯心脏起搏器导线绝缘涂层和乳房植入物多孔涂层都出现了与设备相关的故障，原因是在生理条件下催化了聚合物降解机制。与聚氨酯弹性特性相关的聚醚软段的氧化降解被认为对这些早期植入的PU有害。聚氨酯段的化学性质与体内聚氨酯植入物的性能之间的这种联系，有助于区分生物医学聚氨酯的独特体内环境需求，并促使人们不断努力改善聚氨酯的生物稳定性，以便长期植入。
减少聚醚基聚氨酯氧化降解敏感性的一种方法是利用新的聚醚多元醇构建块，其醚基较少，如聚氧化六亚甲基(PHMO)，这已被证明可以改善体内稳定性，重要的是，还可以改善极性硅氧烷（如聚二甲基硅氧烷，PDMS，低聚物）的化学兼容性、 最近的大量发展，包括PDMS末端官能团的智能选择和使用第二种大二元醇作为段的相容剂，使得PU软段和硬段之间的可控相混合具有优异的机械性能和增强的PDMS-PU体外水解阻力和体内的生物稳定性。最新一代商业化的基于PDMS的生物医学PU采用了两步批量聚合工艺，可以在没有金属催化剂的情况下进行可扩展的大规模生产，并改善了适合医疗设备的机械特性和生物稳定性（例如、 E2A与传统的聚醚PU 80A相比，其优越的生物稳定性已在众多的卵巢皮下植入研究中得到证实。雅培公司基于E2A的Optim心脏导线绝缘材料是一个成功的转化案例，自2006年以来已被临床植入，全球有超过600万患者从中受益。（采购Elast Eon E2A联系富临塑胶）
尽管它们在临床上取得了成功，但最近使用阿伦纽斯加速水解的体外研究引起了人们对基于有机硅聚氨酯共聚物长期生物稳定性的关注。阿伦纽斯型温度加速体外降解模型的一个公认的主要局限性是高而持续的测试温度产生PU微观结构和形态的变化，在体内观察不到。最重要的是，温度加速的体外PU降解结果与Optim (E2A)起搏器导线5年和8年的临床表现中的极小变化不相关。一项对第一批商业化发布的Optim心脏导线的积极监测登记研究，包括14500个设备和73000个病人年，证实了Optim的体内稳定性，在植入超过12年后，所有原因的设备存活率达到98.3%。鉴于加速体外测试在预测实际PU体内稳定性方面存在明显的模糊性，未来的重点应该是改进这些体外模型和验证长期植入研究。建立强大的体外-体内关联性，以自信地加速进一步开发有机硅聚氨酯共聚物，这是临床使用的几个重要医疗设备类别的核心，包括人工心脏瓣膜。
人工心脏瓣膜是行之有效的拯救生命的医疗设备。尽管血栓和钙化等并发症确实发生，但发生率相对较低，瓣膜的性能和寿命被认为是可以接受的。目前，大多数植入的心脏瓣膜都是用固定的外源性心脏组织制成的瓣膜，即牛心包或猪瓣膜。还有一小部分植入的心脏瓣膜采用刚性机械设计，具有一个或多个可旋转的碳盘/瓣膜。碳瓣被认为是非常耐用的，但是，由于非生理性的流动和材料表面的化学性质，需要强烈的抗凝治疗，溶血是一个问题。组织瓣膜只需要轻微的抗凝治疗，表现出良好的寿命，并且可以通过微创导管输送；但是，钙化并发症仍然是一个问题。
由于聚合物的特性可以被仔细调整和控制，多个组织已经仔细探索了将聚合物瓣膜用于人工心脏瓣膜的可能性。除了物理特性外，聚合物瓣膜的几何形状可以有意设计，以确保理想的生理功能，接近原生瓣膜的功能。因此，模塑或溶液加工的聚合物心脏瓣膜提供了低成本、高控制、生理性、微创的人工瓣膜的潜力，具有良好的血液动力学。历史上，许多聚合物已经被探索为瓣膜材料，包括硅橡胶、聚四氟乙烯（PTFE）、膨体聚四氟乙烯（ePTFE）、聚乙烯醇（PVA）、聚（苯乙烯-异丁烯-苯乙烯）（SIBS）和一系列聚氨酯。熟悉的临床问题，如血液动力学、血栓形成和钙化，以及体内降解等，都是主要的挑战。
新的PDMS-PU化学成分不断被报道，试图利用PU的结构-性能关系改善体内生物材料的性能。可以说，到目前为止，含硅氧烷的PU表现出最好的生物稳定性和生物相容性，但经常缺乏最先进的机械性能。医疗设备的特定应用性能需要控制特定的PU机械性能，以及在植入条件下强大、可靠的生物稳定性。例如，合成心脏瓣膜需要高拉伸和撕裂强度、高抗蠕变性和特定的动态模量。在使用新的分子和节段结构生产出具有可控微相形态的硅氧烷基PU之前，PU无法提供这些必要的性能，超过了E2A的已知机械性能。
本研究报告了第一类生物医学级有机硅聚氨酯共聚物（SiPUU）（LifePolymer, LP, Foldax, USA）的化学、体外和体内分析，该产品专门用于人工心脏瓣膜（Tria, Foldax, USA）中的合成瓣膜。经过大量的开发工作，并在一系列出版物中进行了详细描述，LP达到了为确保Tria瓣膜的正常和安全的机械功能而制定的性能目标，包括≥30MPa的极限拉伸强度（UTS），≥500%的伸长率，≥50N mm-1的撕裂强度，≥200 J m-2的撕裂能量阈值，25-35MPa的动态模量，蠕变率<E2A，和生物稳定性≥E2A。LP公布的合成和化学设计利用了五种不同的预聚物构件，包括二胺扩链剂和含硅氧烷的大二元醇和硬段成分，利用氨基甲酸酯和尿素化学，促进共大二元醇软段与硬段的相互作用。LP软段是基于4,4′-亚甲基二异氰酸酯连接的PHMO和远缘α,ω-双（6-羟基乙氧基丙基）-PDMS的20:80（重量比）混合物。LP硬段占总质量的近45%（w/w），包括MDI和1,2-乙二胺（EDA）和1,3-双（4-羟基丁基）-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷（BHTD）的混合物。这种创造性的聚氨酯聚合物结构使这种硅氧烷聚氨酯有别于E2A和另一种类似的生物医学有机硅基聚氨酯PurSil35（荷兰帝斯曼生物医学公司），后者都含有四种连接成分，但值得注意的是，缺乏BHTD和因包含EDA而产生的尿素连接化学作用。创新的多步骤、可扩展的聚合物加工产生了≈50%的PU硅氧烷含量，富含硅的PU表面，以及软段和硬段相之间高水平的氢键相互作用。
二、结果
01.生产规模 SiPUU 的特性
最初的14个LP合成批次已经完成了商业化。每批产品都进行了彻底的特征分析，以确保有一致的、高质量的聚合物，具有生产瓣膜所需的规格。这些批次的数据显示在表1中，原始数据的例子包括在支持信息中。尽管许多规格仍然是专有的，但批次间的生产数据显示了强大的一致性。聚合物机械性能的标准偏差都在平均值的6%以内，Tg标准偏差为<3℃。即使是聚合物分子量凝胶渗透色谱（GPC）数据，通常被认为会产生基于方法的±10%的变异性，也在平均值的16%以内。值得注意的是，分子量、极限拉伸强度和伸长率的平均值明显高于早期SiPUU实验室规模开发的报告，而多分散指数（PDI）保持一致，表明在更大的规模下，工艺能力有所提高。动态模量是确保瓣膜适当运动、血液流动和整体瓣膜密封的一个关键参数，它非常一致，并且远在材料开发和瓣膜规格确定的25-35兆帕目标范围内。撕裂能量阈值，定义为循环作用于瓣膜而不产生切口/撕裂的能量水平，很容易超过200J m-2的最低设计要求，并在主动脉瓣功能期间提供>2倍的安全系数。
表1. 从14个商业批次的LP中汇编的SiPUU特性数据
02.主动脉瓣的制作
Foldax Tria主动脉瓣设计（图1）是为临床前和生物相容性测试而反复制作的100%合成聚合物人工主动脉瓣。该瓣膜由LP瓣膜溶液浇铸在一个放射性聚醚醚酮（PEEK）支架和一个用聚酯缝线固定的PTFE毛毡缝合环上组成。灭菌是通过标准的环氧乙烷方法实现的。为本研究制作的Tria瓣膜经过了所有的制造过程/控制，符合所有人类使用所需的视觉、机械和尺寸规格。
图1 Foldax Tria主动脉瓣有LP小叶，外径23毫米。
03.生物相容性
由于完整的医疗设备最能代表病人的暴露，本研究中描述的生物相容性测试是在一个完整的、已灭菌的Tria心脏瓣膜上进行的，其成分大约为40wt%的LP、40wt%的PEEK和20wt%的PTFE。生物相容性评估是按照ISO 10993标准和良好实验室规范（GLP）规定完成的。表2中提供了每项测试结果的摘要。所有生物相容性测试都符合相关标准，没有发现明显的毒性或组织损伤风险。成功的ISO 10993生物相容性结果，如Tria瓣膜与LP瓣膜的详细结果，是确保病人安全和确保全球植入式医疗设备的监管批准所必需的。
表2. 带LP瓣膜的Tria瓣膜的ISO 10993生物相容性测试结果
04.Tria阀门详尽的萃取物和浸出物分析的毒理学风险评估
气相色谱质谱（GC-MS）和液相色谱质谱（LC-MS）对Tria阀门的详尽萃取物（极性、半极性、极性）进行分析，确定了37种独特化合物和24组相关化合物的低含量（表3）。对PBS和乙醇/水模拟使用的浸出物溶液进行相同的分析，确定了33种独特化合物和11组相关化合物的低水平（表3）。化合物组的例子包括乙二醇、脂肪醇、硅氧烷环、硅氧烷低聚物、二甲基乙酰胺（DMAc）相关化合物、亚甲基二异氰酸酯（MDI）相关低聚物、以及MDI-二醇-硅氧烷相关低聚物。由于这些分析方法的高灵敏度，即使是植入级聚合物，也能识别出非常低水平的可萃取化合。
表3. 通过GC-MS和LC-MS鉴定的Tria阀门的可浸出和可萃取化合物的数量
作为综合毒理学评估的结果，计算了通过GC-MS和LC-MS确定的每个独特化合物和相关化合物组的安全系数（MOS）值。MOS值≥1表示当设备按预期使用时，毒性风险最小且可接受。MOS值<1需要额外考虑，以做出最终的毒性判断。在模拟使用条件下，所有可浸出的化合物以及在积极的、详尽的提取条件下用极性和半极性溶剂确定的那些化合物都被确认为最小的毒性（MOS≥1）。只有在非生理条件下，即在50℃下用正己烷溶剂萃取72小时，才会发现MOS值小于1.0的化合物，范围在0.5和0.9之间。
电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）确定了八种金属，Mg、Al、B、Na、Si、K、Ca和Ba，在详尽的水提取、PBS浸出物分析和乙醇/水浸出物分析中，每个装置的数量至少为1微克。这些元素的MOS值非常高，从79到501 400不等。因此，没有与可提取或可浸出元素有关的毒性问题。
然后考虑了所有可用的数据，以评估Tria瓣膜与LP瓣膜的整体毒理学风险。考虑到成功完成了ISO10993生物相容性测试（包括急性全身毒性和遗传毒性），模拟使用可浸出物分析的最小毒性评估，以及对详尽提取的MOS值明显高估了潜在的生物暴露的理解，结论是带有三个LP叶片的Tria瓣膜代表最小毒性风险。
05.植入羊体内的Tria瓣膜与LP瓣膜的亚慢性临床前组织学评价
八只经过消毒的Tria瓣膜(23mm)带LP瓣膜被成功植入八只羊的主动脉中，为期140天。在两只羊身上植入人类Carpentier-Edwards Perimount主动脉瓣（型号2900-25mm）作为对照。
在140天的研究过程中，没有观察到10只植入瓣膜的绵羊有明显的健康问题。临床化学数据没有发现明显的趋势。在整个研究过程中，所有动物的体重都有所增加。在LP瓣膜和控制瓣膜上都没有观察到矿化、出血或瓣膜表面血栓。此外，两种类型的瓣膜在缝合处都只有极少的炎症，主动脉也没有血栓，是通畅的。LP瓣膜没有纤维组织（pannus）或内皮化。对照组小叶显示有轻微的纤维组织(pannus)覆盖，但没有观察到内皮化。总的来说，Tria瓣膜和邻近组织的大体和显微镜组织病理学评估参数（图2），与对照品相比，LP试验品相似或更优，严重程度极低，在这个动物模型中没有产生任何临床上的重大发现或安全问题。
图2 代表性的140天卵巢研究移植的病理情况。左图：LP Tria瓣膜图像。右图： Carpentier-Edwards Perimount对照组织瓣膜图像。顶部：切除瓣膜和修剪主动脉组织后的大体图像。中间：框架、小叶和周围组织的组织病理学。底部：小叶尖端的组织病理学。所有的组织病理切片都是用H&E染色剂制备的，并以一致的放大倍数显示，如比例条所示。请注意，LP材料不会明显吸收H&E染色剂；因此，LP小叶很难被看到。左图中间的虚线强调了LP材料的边界。
对不靠近瓣膜的器官和组织（肾脏、肺脏、肝脏、胆囊、脾脏、淋巴结和大脑）进行组织病理学评估，没有发现Tria瓣膜特有的任何明显的发现。
06.体外非人灵长类动物房室分流术的血栓形成性
以前由Harker和Hanson描述的体外非人灵长类（NHP）房室分流方法被成功用于评估LP移植物（n = 6）和ePTFE对照移植物（n = 5）的血栓形成性（图3）。这一低血小板沉积比历史上公布的使用氯吡格雷（20mg kg-1）和阿司匹林（10mg kg-1）的ePTFE移植物的结果低一个数量级，60分钟后的血小板沉积为2.0 ± 0.4 × 109。对LP和ePTFE移植物血小板沉积的统计比较证实，ePTFE移植物在30、45和60分钟内经历了明显（t检验中p < 0.05）的血小板附着。
图3 体外循环的NHP血液通过与硅橡胶房室分流管（左和右）粘合的LP移植（中心）。
六个LP移植物中的四个上的纤维蛋白积累足够低，低于伽马计数器的检测限。LP装置上的纤维蛋白平均量为0.003±0.007毫克，比ePTFE装置纤维蛋白的平均沉积量0.844±1.156毫克低几个数量级。一个ePTFE复制品的纤维蛋白积累量（2.897毫克）是其他四个复制品平均值（0.331毫克）的8倍以上。无法确定这一异常数据点的理由。有了这个离群点，ePTFE纤维蛋白数据的标准偏差很高，与LP相比，没有发现统计学上的显著差异（t检验，p = 0.179）。从ePTFE数据集中去掉这个离群点后，LP和ePTFE样品之间出现了统计学上的显著差异（p = 0.027）。
07.兔子皮下植入物中的 Prestrained LP 薄膜的体内生物稳定性
将预应力LP和对照聚氨酯（ 80A和55D）哑铃成功植入八（8）只兔子的背肌上方的皮下，为期3-6个月。每种类型的样品都植入了十六（16）个。在48个植入的样本中，手术并发症或感染要求10个样本（3个LP和7个对照）在植入后30天内被切除并从研究中移除。研究期间没有发现其他与植入物有关的健康问题。
图5详细介绍了视觉检查评分的结果，它试图对任何可见的退化程度进行分类。6个月的兔子模型成功地在阳性对照样品中造成了明显的退化（得分6分）。在阴性对照中甚至发现了适量的表面降解（4分）。请注意，聚氨酯55D阴性对照是一种在临床上成功植入几十年的生物材料，但在体内和加速的体外测试中显示出温和的降解。我们的对照结果证实，该兔子模型中150%的应变水平是PU降解的强烈加速剂。即使在这种加速水平下，LP样品也没有显示出退化的视觉迹象（得分1）。
图5 通过目视检查LP测试品和PU对照品流延膜在150%的应变作用下6个月后的降解情况。左边提供了每个评级的定义。该图中显示的数值代表了每组的总体降解评估。
图6提供了典型的场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）图像和6个月后LP和对照组的一般观察结果。请注意，由于用光镜评估透明样品表面的挑战，FE-SEM评估可能与相同样品的视觉评估结果有一定的偏差。阳性对照组（80A）显示出明显的表面凹陷、开裂，以及一个样品的中心区域完全分离。阴性对照（55D）在两个时间点都显示出轻微的表面凹陷和开裂。请注意，与目测相比，FE-SEM成像在阴性对照中发现的点蚀和浅层裂纹较少。LP试验品即使在6个月时也没有显示出点蚀、开裂或任何其他类型的退化迹象。
图6 LP试验品和PU对照品铸膜在150%的应变下体内6个月后的代表性FE-SEM图像。图片显示了每组中两个有代表性的被切除的狗骨的中心。比例尺=500μm。
这些研究数据表明，LP材料具有高度的生物稳定性，即使在体内模型中被>10倍于瓣膜小叶的预期应变所加速。此外，FE-SEM-能量色散X射线分析（EDAX）在3个月或6个月的时间点上都没有发现LP试验品上有钙沉积的证据（数据未显示）。
三、讨论
一个完全合成的、临床上可靠的心脏瓣膜假体一直难以实现，需要高度复杂的瓣膜设计、生物材料组合、制造限制、植入工具和手术技术。新设计的Tria主动脉置换瓣包含了一种新的合成SiPUU的弹性聚合物瓣膜，其商品名为LifePolymer（LP，Foldax，USA）。以前的一系列出版物广泛地描述了LP的合成化学、浇铸体薄膜微结构、硅表面富集、独特的聚合物加工以及与合成心脏瓣膜应用有关的广泛物理特性。[32-35]用高性能SiPUU替代传统的异体心包组织瓣膜，具有高度控制瓣膜设计、理想和定制的机械性能、强大的供应链和较低的制造成本等优点。尽管如此，任何替代心脏瓣膜的翻译、临床测试和商业化都需要根据一些指导和标准文件进行开发和测试，包括ISO 10993 "医疗器械的生物学评估"、ISO 5840-1 "心脏瓣膜支架：一般要求 "和ISO 5840-2 "心脏瓣膜假体：手术植入的心脏瓣膜替代物"。一系列旨在验证LP瓣膜材料和Tria主动脉瓣假体的生物相容性、安全性和稳定性的研究结果与这些指南一致。连同早先报道的关于这种新的SiPUU共聚物的工作，一个详尽的数据集现在证实了LP作为替代心脏瓣膜的适用性。
这些包括LP的溶剂加工机械性能（弹性、拉伸强度、撕裂强度、蠕变）的重要基准，这些性能归因于独特的co-macrodiol链延伸段的相互作用，新的硬段也含有硅氧烷化学成分，铸造表面一贯且大量富含硅氧烷低能块，以及氨基甲酸酯和尿素连接赋予稳定性和常规氢键。将这种台架合成扩展到装置转化的第一阶段，商业化合成的多个LP批次的规模显示了高度的工艺控制。与以前报告的实验室规模的特性相比，分子量、极限拉伸强度和伸长率的适度提高进一步表明在更大的规模上工艺能力的改进。
ISO 10993生物评估标准已在全球范围内被采用，作为验证包括心脏瓣膜在内的成品医疗设备的生物相容性的风险管理过程的一部分。由于心脏瓣膜长期与血液和组织接触，ISO 10993-1要求进行最严格的测试，包括细胞毒性、皮内反应性、材料介导的热原性、全身毒性、植入效应、血液相容性和基因毒性。如果该设备含有任何已知的诱变剂、致癌物或生殖毒素，还需要进行致癌性评估。
带LP叶片的Tria瓣膜通过了所有标准的生物相容性测试，确定LP在这种情况下无细胞毒性、无刺激性、无致敏性、无热原性、无致癌性、无致畸性，并且不产生急性全身毒性（表2）。在一个卵牛模型中进行的长期亚慢性毒性测试表明，没有局部或全身毒性的风险。通过标准的AMES和小鼠淋巴瘤方法，Tria阀门材料也被确定为无致癌性。这些结果以及LP配方中没有任何已知的遗传毒性或致癌性化合物，证明不进行致癌性试验是合理的，这与ISO 10993-1准则一致。
根据ISO 10993-4，任何心脏瓣膜的血液兼容性必须通过溶血和体内/体外血栓研究来评估。如表2所示，Tria瓣膜材料是不溶血的，并且在体外研究中，部分凝血活酶时间和补体激活显示出可接受的低凝固率。使用基于LP的AV NHP分流器进行的体外血栓形成试验（图4）进一步证明了LP的低凝血激活率，在原位产生几乎无法检测的血小板附着和纤维蛋白沉积水平，这都是血栓形成的关键标志。对于任何心脏瓣膜材料来说，Tria瓣膜和LP瓣膜都是必不可少的，在两个不同的大型动物模型中都显示出了卓越的血液相容性（见图2和4）。这要归功于LP瓣膜表面高含量的、非致密的硅氧烷，众所周知，它有利于血液相容性。
图4 血小板在NHP房室分流环的LifePolymer（LP）和ePTFE参考移植物上的沉积情况。数据显示为平均值，误差条代表一个标准差。P值代表在特定时间点对LP测试组（n = 6）和ePTFE参考组（n = 5）进行的双侧t检验。
医疗设备中的聚合物生物材料可能含有可提取的和潜在的有毒的低分子量物种，如低聚物、增塑剂、抗氧化剂和加工助剂等，其中相当一部分不良反应是由于化合物或元素的意外释放。出于这个原因，ISO 10993生物相容性测试使用提取技术来分离这些化合物进行生物评估。ISO 10993-18描述的一个典型的补充分析方法是对在模拟使用条件下（可浸出物）和/或使用侵蚀性提取溶剂和条件下可提取的化合物和元素进行鉴定、定量和毒理学评估，即 "穷举"。通过这种方式，设备的毒理学安全性不仅可以通过生物测试来确认，还可以通过最先进的化学分析，如GC-MS、LC-MS和ICP-MS，再加上毒理学风险评估。
必须认识到MOS值的计算只是毒理学评估的一个要素，它涉及多个高度保守的假设。首先，该计算假设所提取的每种化合物在24小时内100%被生物利用，在病人的一生中每天释放相同的数量。在实际使用条件下，预计一次性植入的化合物会在数周、数月甚至数年内以不断降低的浓度渗出，从而导致毒性风险大大降低。此外，在实际使用条件下，许多通过这种苛刻的极性溶剂萃取而确定的化合物可能永远不会从体内的阀门中释放。这一点在比较详尽的萃取数据和可浸出物数据时可以看出。因此，MOS的计算方法大大高估了潜在的生物暴露和毒理学风险。
在考虑了全部数据，包括可浸出化合物和元素的无毒评估、详尽提取的毒理学数据以及成功的ISO 10993-1生物相容性测试结果（表2），包括急性全身毒性、遗传毒性和体外致血栓性（图4）后，得出结论，Tria瓣膜及其三个LP瓣膜的毒性风险最小。
植入物的生物相容性和生物安全性，特别是在设备的机械功能方面，如心脏瓣膜，通常包括对材料生物稳定性的进一步评估。ISO 10993第13、14和15部分描述了旨在识别因生物材料降解而产生的化合物的测试协议。如果指导文件或文献报告提供了与正在考虑的设备和特定材料有关的方法，体外研究是合适的。过去的出版物表明，LP在体外和体内对侵蚀性氧化攻击的抵抗力一般都很出色。过去40年中，许多出版物对PU弹性体采用了加速聚合物降解的体内模型。6个月的兔子植入研究描述了在皮下植入前对材料施加150%的恒定应变来加速聚合物的体内降解。这个应变水平是主动脉瓣小叶中预期应变的10倍以上。与以前的研究一致，这种水平的应用应变引起了软质聚醚胺酯，如80A的显著点蚀、开裂和材料降解（图6）。即使是在临床上成功用于各种植入物的55D也不能避免在这种侵蚀性测试中的降解（图6）。相比之下，即使在这些加速条件下植入6个月后，紧张的LP样品也没有显示出降解的迹象（例如，点蚀或开裂）。其他硅氧烷-聚氨酯以前也证明了类似的生物稳定性，包括ElastEon2A和PurSil，两者都有成功的植入应用。添加独特的新尿素段键和含硅氧烷的BHTD扩链剂，以提高LP的机械性能，这是有效的瓣膜功能所需要的，但在这种加速评估中并没有损害其体内的生物稳定性。
四、结论
对心脏瓣膜假体瓣膜的机械和生物性能要求非常苛刻。尽管合成聚合物瓣膜具有无可争议的优势，但目前还没有能够实现可靠设备商业化的例子。之前的大量工作强调了一种专门用于心脏瓣膜瓣片的硅氧烷聚氨酯生物材料的重点开发。结合高水平的硅氧烷和优化的尿素连接剂化学成分、连接的共聚物和含硅的硬段，LP展示了瓣膜使用的理想动态模量，具有高机械强度、低蠕变、高撕裂能量阈值，以及体外和体内的生物稳定性。规模化的批次间聚合物生产的一致性、出色的ISO 10993生物相容性和体外血栓形成结果、不令人担忧的毒理学风险评估、成功的慢性绵羊植入以及有希望的兔子生物稳定性测试结果都证实了Tria瓣膜装置设计中的LP生物材料的生物安全性。这些新的和有希望的结果，加上实验室规模生产的有吸引力的原始LP属性集，为继续在完全合成的心脏瓣膜中应用LP瓣膜提供了多样化和实质性的证据基础。
五、实验部分
01.硅氧烷基聚脲（SiPUU）的合成
简而言之，α,ω-双(6-羟基乙氧基丙基)聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)在擦拭式薄膜蒸发器中纯化，去除低分子量的环状硅氧烷化合物。通过将PHMO和MDI以2:1的摩尔比在80℃下反应2小时来合成连接的PHMO。预聚物的制备是将PDMS和连接的PHMO混合在一起，加入滴定的MDI以确保聚合物的完全反应，并在80℃下搅拌2小时。加入1,3-双（4-羟基丁基）-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷（BHTD）并进行2小时的反应后，开始进行链的延伸。链延伸的最后步骤是溶解10% w/v DMAc，然后加入乙二胺（EDA）。由此产生的LP的近似摩尔成分是50%的MDI、3%的连接PHMO、17%的PDMS、15%的BHTD和15%的EDA。LP中没有加工助剂、抗氧化剂或其他添加剂。为测试目的，从每批LP中用溶液浇铸出LP薄膜（200μm厚），使用LP-DMAc溶液（25% w/w），用铸膜刀涂在玻璃板上，然后在55℃下干燥一夜。
每批LP-DMAc溶液的分子量（Mw、Mn、PDI）是用GPC系统测定的，该系统由HPLC泵/控制器、RI检测器、Styragel HT2、HT3、HT4、HT5柱（Waters）组成，温度为80℃，流动相（DMAc与50mm LiBr）流量为1.0ml min-1。分子量值是相对于单分散聚苯乙烯标准的报告。
玻璃转化温度（Tg）是用DSC（Discovery，TA仪器）测定的。每批干膜样品（3-5毫克）在-90℃下平衡，然后在-90和100℃之间进行加热（10℃/min-1）、冷却（5℃/min-1）和再加热（10℃/min-1）循环。测定了加热、冷却和再加热期间的Tg值。
使用钻石衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）系统（iS50，ThermoFisher）对每个LP批次的薄膜进行光谱分析，光谱范围为525-4000厘米，平均32次扫描，分辨率为4厘米-1。使用相关系数计算（QCheck，Omnic软件）将每个光谱与历史参考光谱进行比较。系数为1.0表示完全匹配。
从每一批次的LP膜上切下七（7）个重复的ISO 37-2型狗骨头。使用拉伸测试系统（Mark-10），在环境条件下，以100毫米/分钟的速度将狗骨拉到破坏。计算每批LP的UTS和断裂伸长率。
对于每个批次，从LP薄膜上打出六（6）个重复的样品（10毫米×42毫米），并在每个样品的一个边缘上做一个控制深度的切割。使用机械测试仪（Electroforce 3200，Bose Instruments），这些样品在37℃的水中以10赫兹和0.5兆帕的最大应力进行了一组50000次拉伸疲劳循环。然后在37°C水中以越来越高的应力水平对样品进行50 000次疲劳循环，直到裂纹/撕裂增长超过0.1 nm cycle-1，此时根据加载能量和样品尺寸计算出撕裂能量阈值（J m-2）。动态模量（MPa）被计算为在0.5 MPa应力水平循环加载期间应力-应变曲线上最小和最大点的斜率（图S5，支持信息）。
02.主动脉瓣的制作
Foldax Tria主动脉瓣的设计（图1）是一种100%合成聚合物的人工主动脉心脏瓣膜，有一个灵活的、可放射的PEEK（Zeniva，Solvay）支架和环形底座，直径在17至27毫米之间。使用精心控制的溶剂铸造工艺，在框架上就地制作了三个具有专门设计的厚度轮廓的柔性LP瓣膜。浸渍速度和方向、LP聚合物溶液（在DMAc中）的粘度、环境温度和湿度以及干燥参数对于确保铸造的小片符合微米级精度的尺寸规格至关重要。聚合物薄膜浇注后，进行了机械修剪步骤，以最终确定LP小片的尺寸。使用聚酯缝合线将PTFE毛毡缝合环固定在环形PEEK阀门底座上，缝合线穿过底座外环上一系列有规律间隔的孔。通过标准的环氧乙烷方法实现消毒。
03.生物相容性评估
对已灭菌的带LP瓣的Tria主动脉瓣进行了一系列基于ISO 10993的生物相容性测试。一个完整的Tria心脏瓣膜由LP瓣膜（重量比≈40%）、植入级PEEK材料制成的刚性框架（重量比≈40%）、植入级PTFE材料制成的缝合环（重量比≈20%）和市售的聚酯缝合线组成。表2提供了所进行的具体测试的概述，所有这些测试都是按照FDA的GLP规定（21 CFR Part 58）进行的。测试方法的摘要见表S2，支持信息。
所有的临床前生物稳定性研究都是按照美国国立卫生研究院（NIH）的《实验动物护理和使用指南》进行的，其中包括由试验设施机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。该试验设施已在美国农业部注册（USDA，#41-R0074），并得到了实验动物护理评估和认证协会（AAALAC，aaalac.org）的认可。
04.详尽的提取和浸出物分析的毒理学风险评估
Foldax Tria主动脉瓣（包括LP瓣）的潜在毒理学风险是用一式三份的水（极性）、50%的乙醇/水（半极性）和正己烷（非极性）溶剂进行穷举，在50℃下进行72小时评估。用四极杆飞行时间气相色谱质谱（QTOF-GCMS）、四极杆飞行时间液相色谱质谱（QTOF-LCMS）和ICP-MS鉴定从阀门中提取的任何化合物/元素。通过QTOF-GCMS和带电荷气溶胶检测和紫外检测的超高压液相色谱法进行相对定量，一式三份。更多的分析方法细节见支持信息。当有一致的毒理学数据时，对化合物进行了分组。一个化合物组的每个设备的总浓度代表了一个组内每个单独化合物的数量之和。所有发现的最大含量超过分析评价阈值（AET）1.5微克设备的化合物都被报告，这是ICH M7指南支持的限制。ICP-MS元素数据的报告极限为1.0μg-1。在随后的毒理学风险评估中，使用符合ISO 10993-17:2002 R2008的方法，详尽提取的数据是关键输入。
还进行了一式三份的生物相关的模拟使用浸出物分析，使用PBS（极性）和40%乙醇/水（半极性）作为萃取溶剂，在37℃下进行72小时。
可浸出物和穷举法的毒理学评价/风险评估过程由经验丰富的毒理学家进行，并遵循ISO 10993-17:2002 R2008中描述的一般方法。对暴露于可萃取化学品/元素的潜在有害影响的识别和定性包括建立化学品/元素的可容忍摄入量TI[μg kg-1 day-1]，计算人类剂量当量HDE[μg kg-1]，以及安全系数MOS=TI/HDE。由于Tria心脏瓣膜已被证明具有非致突变性，对于没有替代数据的化合物，默认的TI为1.5μg kg-1 day-1，即Cramer III级毒理学关注阈值（TTC）。
05.亚慢性毒性（140天）的临床前评估
在140天的植入期内，对健康卵牛模型中带有LP瓣的Tria主动脉瓣进行了评估。将灭菌的Foldax Tria瓣膜（23mm）植入8只动物体内（n = 8个测试样本）。在两只动物身上植入无菌的人类Carpentier-Edwards Perimount主动脉生物假体2900-25mm型号，作为临床上可接受的基准对照装置（n = 2个对照）。
在入选前，对动物进行了环形尺寸的筛选。总共10只（2只雌性，8只雄性）绵羊，体重40-60公斤，接受左胸切开术，准备进行心肺分流。一旦进入旁路，主动脉被打开，按照制造商的说明植入测试或控制装置。在手术过程中，根据需要，通过静脉注射肝素使激活的凝血时间保持在250秒以上。然后缝合主动脉，将动物从旁路断开。术后没有进行抗凝血治疗。从第7天开始，定期评估一般健康状况和临床化学指标（CBC、血清化学指标、低密度脂蛋白、游离血红蛋白、网织红细胞计数、凝血功能检查），此后每月一次。在植入后约140天，动物接受了镇静的终结程序，并进行了大体的尸检。收集瓣膜、心脏和肺，以及淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏和大脑的组织，进行组织学评估。从Tria主动脉瓣收集的所有组织病理学数据都直接与对照瓣进行了比较。
这项临床前研究是根据美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》进行的，其中包括测试设施IACUC的批准。该试验设施已在美国农业部注册（#41-R0074），并得到AAALAC（aaalac.org）的认可。
06.体外房室分流术血栓形成性研究
通过在22%（w/w）LP/DMAc溶液中浸涂不锈钢心轴来制备六（6）个LP移植物（直径4mm，长70mm）。每个样品在手套箱中于85%RH下浸涂四次。每次涂层之间，样品在55℃的烘箱中旋转30分钟。最后一次涂层后，样品在55℃的烘箱中保持过夜。在流动的RO水下从心轴上取出LP移植物。对移植物进行包装并通过环氧乙烷进行消毒。
硅橡胶管（内径4.0毫米，外径6.5毫米）与移植物的两端相接，用硅酮医用胶和上面的15毫米长的氟化乙烯丙烯热收缩管粘合（图3）。
以前由Harker和Hanson描述的体外NHP房室分流方法被用来评估血管移植的血栓形成性[38]。在两天的时间里，对六个LP移植物进行了测试。在每次研究开始前，CBC值和血小板计数被确认为正常。通过手术建立了硅橡胶管的股静脉分流。将自体的111In标记的血小板和125I标记的纤维蛋白原（集合）引入受试者的血液循环。用等渗盐水给移植段打底，并将其加入分流回路中。用一个远端钳子控制通过回路的血流，并持续监测，使其达到≈100毫升/分钟。通过使用伽马相机的闪烁图谱，每3分钟测量移植体中央20毫米处的血小板积累，持续1小时。曝光1小时后，将移植段从分流回路中取出，用等渗盐水冲洗，直到所有可见的血液被清除。然后将LP移植物两侧的硅胶管取下，将LP移植物在4℃下保存30天，允许111In衰变，并用伽马相机对每个LP移植物中央50毫米的125I标记的纤维蛋白/纤维蛋白原沉积进行量化。
在15、30、45和60分钟时，将LP移植物上的血小板和纤维蛋白沉积与类似大小的ePTFE移植物（n = 6）的历史数据进行比较，采用t检验。0.05的P值被认为是有统计学意义的。
这项临床前研究是根据美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》进行的，其中包括测试设施IACUC的批准。该试验设施已在美国农业部注册（#92-R-001），并得到AAALAC（aaalac.org）的认可。
07.统计分析
连续变量以平均值±标准差表示。体外血小板粘附和血栓形成的统计分析是在试验组和对照组之间进行的，使用微软Excel中的双侧t检验。每组在每个时间点至少由五个数据点组成。数据按收集到的数据使用，不做预处理。显著性被定义为P≤0.05。
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